Enzimele de restricție sunt enzime care taie atât ADN unic cât și dublu catenar. Fiecare enzimă de restricție are o secvență nucleotidică specifică, numită un situs de restricție, pe care o recunoaște și o reduce. Enzimele de restricție sunt utilizate pentru secvențarea ADN-ului, analiza mutațională și clonarea și amplificarea ADN-ului. Oamenii de știință folosesc enzime de restricție pentru a introduce genele de interes în vectori de expresie, molecule de ADN care se pot replica separat de ADN-ul cromozomial. Vectorul care conține gena de interes poate fi apoi introdusă într-o tulpină bacteriană pentru exprimarea și caracterizarea proteinelor.
Videoclipul zilei
Pasul 1
Identificați site-urile cu enzime de restricție pe vectorul dvs. prin vizionarea unei hărți de restricționare. Harta de restricționare vă va spune ce enzime vă va tăia vectorul și unde.
Pasul 2
Alegeți o enzimă de restricție care are de asemenea un sit prezent pe inserția genei, examinând secvența REPLACEului. Asigurați-vă că situl de restricție se află într-o poziție pe inserția dvs. care este în afara geniului de interes, astfel încât să nu pierdeți nicio parte a genei.
Pasul 3
Asigurați-vă că nu există duplicate ale locului de restricție oriunde în inserția genei sau vectorul. Acest lucru va cauza multiple tăieri în ADN-ul dvs. și vă va oferi date înșelătoare.
Pasul 4
Încercați să alegeți enzime de restricție care taie cu capete lipicioase, mai degrabă decât capete de tăiere. Capetele lipicioase apar atunci când enzima taie ADN-ul dublu catenar într-o manieră eșalonată, lăsând o singură bandă lată, care facilitează atașarea cu o tăietură inserată în sens contrar. Primele brute apar atunci când ADN-ul dublu catenar este tăiat în mod neted și acestea sunt mai greu de atașat.
Pasul 5
Alegeți o altă enzimă de restricție pentru ambele capete ale inserției dvs. pentru a vă asigura că este inserată în vectorul în orientarea corectă și pentru a vă asigura că vectorul nu se atașează la el însuși.
Pasul 6
Încercați să alegeți două enzime de restricție care funcționează bine în același sistem tampon și temperatură. Dacă acest lucru nu este posibil, executați fiecare digestie separat.
Lucruri de care aveți nevoie
- Secvența inserției genelor
- Harta restricționării vectorului de alegere
- Lista enzimelor de restricție și site-urile lor tăiate
Sfaturi
- de restricție pe o secvență ADN rapid. Un astfel de program este din New England BioLabs.
